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影像学上，肺腺癌（LUAD）中的磨玻璃结节（GGN）和部分实性结节（PSN）在临床涌现、生物学特质和预后方面存在显耀异质性。最近的一项有计划中，成都中医药大学附庸病院由凤鸣阐述团队对LUAD不同影像学表型的异质性及影响肿瘤演变的辩论因素进行探讨，通过颐养CXCL9+TAMs和TREM2+TAMs的相对比例和功能状况，为守护TME内的动态均衡和升迁免疫调整后果提供了潜在的调整计谋。

著述先容

题目：单细胞RNA测序揭示肺腺癌磨玻璃结节和部分实性结节侵袭和鬈曲历程中的免疫微环境生态位调动 杂志：Molecular cancer 影响因子：27.7 发表时刻：2024年11月

#1

有计划配景

Background

跟着高分辨率低剂量探究机断层扫描的闲居使用，以肺结节神志检测到的LUAD病例越来越多，其中GGN和PSN是两种最常见的类型。具有GGN特征的早期LUAD术后5年无病活命率接近100%，而具有更多实性要素的PSN涌现出更高的鬈曲和疾病进展风险。咫尺还莫得全面的有计划评估GGN和PSN特征对微浸润腺癌（MIA）、浸润性腺癌（IAC）和鬈曲性肺癌（MLC-LUAD的分子和免疫学特征的影响。为了神情GGN和PSN-LUAD的进化轨迹，有计划东说念主员为GGN和PSN-LUAD生成了肿瘤组织和正常肺组织在疾病进展各个阶段（MIA/IAC/MLC）的单细胞转录组图谱。这些图谱拿获了LUAD侵袭和鬈曲历程中TME细胞群的异质性，具有不同的发射学特征。诳骗公开可用的患者测序数据和多重免疫荧光工夫，有计划东说念主员进一步笃信了TME细胞的散布模式。在这种闲居的异质性中，有计划东说念主员笃信了驱动肿瘤扼制或促进表型的重要TAM亚群-TREM2+TAMs和CXCL9+TAM，并使用类器官和基因剪辑工夫进展了颐养其分化的潜在机制。总之，该有计划提供了GGN和PSN-LUAD进化轨迹的分子特征的潜入表征，具有伏击的临床意旨。

#2

有计划想路

Methods

有计划东说念主员揭示了GGN-和PSN-LUAD的不同TME模式，并笃信CXCL9+TAMs和TREM2+TAMs是影响两种影像学表型之间侵袭和鬈曲生态学各异的重要TME亚群。进一步神情了一个由CXCL9+TAMs和TREM2+TAMs组成的促肿瘤或抗肿瘤变量的高度互助汇注，探索了它们的潜在源流，与T细胞和肿瘤细胞的互相作用，以及辩论颐养基因在不同发射学亚型LUAD中的抒发模式。该有计划为LUAD的异质性提供了新的生物学视力，其影像学特征的万般性可能会影响临床LUAD有计划的精确医学进展。

#3

有计划适度

Results

1. GGN-和PSN-LUAD的单细胞时势

有计划东说念主员采集成都中医药大学附庸病院胸外科和四川省肿瘤病院19例未经调整的LUAD患者崭新手术切除的肺组织标本，包括4例癌旁正常肺组织标本；GGN-MIA、GGN-IAC和GGN-MLC样本各3份；3份PSN-MIA、3份PSN-IAC和1份PSN-MLC样本。将样品消化成单细胞悬液后进行ScRNA-seq工夫检测，过滤后共得回188594个细胞，分为12个簇，并使用经典标志基因抒发进行属目，包括T细胞、上皮细胞、B细胞、内皮细胞、巨噬细胞、树突细胞、成纤维细胞、魁梧细胞、中性粒细胞、浆细胞、淋巴内皮细胞和平滑肌细胞。随后，对异质性进行分析发现，PSN-LUAD组和GGN-LUAD组T、B淋巴细胞富集，髓系细胞浸润减少。此外，跟着GGN-LUAD和PSN-LUAD的侵袭和鬈曲发生变化，肿瘤内细胞的组成在组织特异性常住东说念主群中涌现出各异（图1）。适度标明，不同肿瘤组织阶段细胞组成的各异可能与疾病进展机制辩论。

图1 LUAD伴GGN和PSN的影像学特征涌现为肿瘤和癌旁组织内的细胞景不雅

2. PSN-和GGN-LUAD侵袭鬈曲历程中上皮细胞和内皮细胞的抒发模式

为了准确别离TME中的肿瘤细胞和正常上皮细胞，有计划东说念主员对31498个上皮细胞进行了降维和聚类分析。通过整合来自拷贝数变异（inferCNV）、CopyKat和谱系特异性基因抒发的信息，得胜地别离了恶性上皮细胞和非恶性正常上皮细胞。对非恶性正常细胞的分析笃信了上皮细胞亚群，包括AT1、AT2、基底细胞、纤毛细胞、棒状细胞和杯状细胞。进一步有计划上皮细胞的异质性。采选Cytotrace、cellcyclesing、AddModuleScore等要领评估恶性肿瘤细胞的特征。Cytotrace评分适度标明肿瘤细胞群涌现出更强的谱系分化智力，AddModuleScore适度标明肿瘤细胞涌现出更高的EMT特征。

此外，有计划东说念主员不雅察到PSN-LUAD组不同阶段的Cytotrace评分和EMT评分多量高于GGN-LUAD组，标明两组的恶性进程不同。Ki-67在除G0期外的统统细胞周期中均有抒发，Ki-67高抒发是恶性进程较高的标志。染色适度涌现，跟着疾病从MIA进展到IAC期，Ki-67抒发显耀增多，MLC期的Ki-67染色强度进一步显耀增多。此外，在活命分析中，编码Ki-67的基因MKI67与预后显耀辩论。这些数据凸起了GGN-和PSN-LUAD不同进展阶段上皮细胞的转录设施异质性，这可能与临床疾病进展辩论。内皮细胞是组成淋巴管的伏击细胞类型，可影响肿瘤微环境的养分运输和氧供。检测适度涌现，GGN-和PSN-LUAD在TME中均涌现出显著的内皮细胞比例裁减，PSN-LUAD涌现出更低的内皮细胞比例。为了进一步不雅察内皮细胞不同亚型的变化趋势，有计划东说念主员将内皮细胞亚成簇，并将其属目为六种细胞类型：动脉细胞、毛细血管细胞、毛细血管_aerocyte细胞、Tip细胞、静脉细胞和淋巴细胞。Velocity分析涌现Tip细胞定位于Vein内皮细胞和Capillary内皮细胞之间的发育分化轨迹，Cytotrace适度标明Tip细胞具有更强的分化智力。此外，与GGN-LUAD样本比拟，在PSN-LUAD样本中不雅察到更高比例的Tip细胞，这可能是临床不雅察到的PSN-LUAD更快的侵袭和鬈曲的潜在机制之一（图2）。

图2 上皮细胞和内皮细胞在GGN- PSN-LUAD侵袭鬈曲历程中的抒发模式

3. 对髓系细胞的详备分析揭示了CXCL9+TAMs和TREM2+TAMs驱动的免疫微环境生态位变调

为了笃信对肿瘤发展至关伏击的髓系细胞，有计划东说念主员探索了伏击细胞亚群的功能。发现巨噬细胞组成了一个主要的髓系细胞簇，并阐扬了主要作用。RNA速率涌现，除RTM+TAMs外，其他TAMs均发祥于经典单核细胞，这为有计划巨噬细胞分化轨迹提供了表面标的。M1和M2评分涌现，CXCL9+TAMs的M1评分和TREM2+TAMs的M2评分在巨噬细胞亚群中最高。进一步分析发现，TREM2+和CXCL9+TAMs之间存在潜在的拮抗关系。Monocle2分析发现，在GGN-和PSN-LUAD的不同阶段，CXCL9+TAMs的轨迹树涌现出一致的分化，标明CXCL9+TAMs在LUAD进展的不同阶段涌现出换取的功能。在单核细胞向CXCL9+TAMs分化历程中，CXCLs显耀上调，其中CXCL9的上调最为显耀。此外，CXCL9+TAMs分化辩论基因与免疫颐养高度辩论。拟时序分析揭示了TREM2+TAMs中的细胞分化异质性，凸显出在状况4和7时，TREM2+TAMs中的SPP1基因抒发水平升高。不同LUAD疾病阶段的细胞水平变化定量适度涌现，在LUAD MIA-IAC阶段，TREM2+TAMs倾向于涌现SPP1-特征，而在LUAD-MLC阶段，SPP1+TAMs的比例出现高涨。PSN-MLC中SPP1+TAMs的比例显耀高于GGN-MLC。此外，有计划东说念主员不雅察到TREM2+/SPP1-TAMs中VEGFA基因显耀上调。在肺腺癌浸润的晚期，TREM2+TAMs主要涌现为SPP1+的特征。同期，各异基因分析涌现，在TREM2+/SPP1+TAMs中，SPP1、CSTB、GPNMB、CD9和MPP9等基因抒发上调。多重免疫荧光适度涌现肿瘤组织中存在TREM2+/SPP1+TAMs和TREM2+/SPP1-TAMs。这些标志基因的抒发模式相沿对TREM2+TAMs分化通路的推测，并进一步考证了拟时序轨迹分析的准确性（图3）。这些适度标明CXCL9+TAMs和TREM2+TAMs的改变对LUAD的演变和进展有显耀影响，并可能解释PSN-LUAD和GGN-LUAD之间不同的发展趋势。

图3 髓系细胞的详备分析

4. 免疫微环境中淋巴样细胞浸润特征的变化及在GGN -和PSN-LUAD进展和鬈曲中的作用

通过比较NC、GGN-MIA、GGN-IAC、GGN-MLC、PSN-MIA、PSN-IAC和PSN-MLC中T细胞比例的变化，揭示T细胞在GGN-LUAD和PSN-MLC侵袭和鬈曲历程中的TME浸润。有计划发现，与NC组比拟，GGN-MIA、GGN-IAC、PSN-MIA组T细胞比例显著升高。而后，有计划东说念主员左证经典谱系标志物的抒发笃信了12个T细胞亚群，不雅察到CD8+Trm细胞比例在GGN-LUAD和PSN-LUAD中握续增多，且在GGN-MLC阶段的比例高于PSN-MLC阶段。有计划东说念主员还柔软了另一种淋巴细胞谱系细胞类型-B细胞。B细胞被细分为三个簇：启动B细胞、记念B细胞和浆细胞，对三种B细胞亚型的比例进行分析发现不存在不同组间表型比例的显耀各异，说明B细胞主导的免疫微环境的变化与组织中B细胞的总体浸润品貌相关。诳骗CellChat，有计划东说念主员潜入分析了T细胞、B细胞和巨噬细胞亚群在PSN-LUAD和GGN-LUAD进展和鬈曲中的重要作用。发咫尺GGN-MIA和GGN-IAC阶段，与CXCL信号通路辩论的细胞间互相作用显耀增强，这一风景也在PSN-LUAD的MIA-IAC阶段得到考证。此外，有计划东说念主员不雅察到在MLC阶段，CXCL通路在GGN-MLC和PSN-MLC组中活性裁减。然则，SPP1通路活性在PSN-MLC阶段特异性增强（图4）。有计划标明，肿瘤细胞接受到的SPP1信号主要源流于CXCL9+TAMs除外的细胞，如TREM2+TAMs和RTM+TAMs，其中TREM2+TAMs是PSN-MLC阶段单核细胞源性巨噬细胞比例最高的细胞。

图4免疫微环境中淋巴样细胞浸润特征的变化及在GGN-和PSN-LUAD进展和鬈曲中的作用

5. IFN-γ调控CXCL9+TAMs与CD8+Trm细胞之间的互相作用，影响GGN-和PSN-LUAD侵袭鬈曲的进展

随后，有计划东说念主员探索了CXCL9+TAMs和TREM2+TAMs之间的信号转导在GGN-和PSN-LUAD侵袭和鬈曲中的伏击机制。在CXCL9+TAMs中，IFN-γ反应、炎症反应和P53_PATHWAY等通路愈加活跃；在TREM2+TAMs中，血管生成、EMT和NOTCH_SIGNALING等通路更活跃。IFN-γ反应路线活性的评分适度标明其在CXCL9+TAMs中涌现出较高的活性。与不同GGN-LUAD分期比拟，PSN-LUAD的IFN-γ信号通路活性较低。左证Cellchat分析适度，有计划东说念主员评估了在GGN-和PSN-LUAD侵袭和鬈曲历程中IFN-γ信号的源流：GGN-LUAD侵袭历程中，多种免疫细胞开释IFN-γ：CD8+Trm细胞、CD8+GZMK_Teff、CD8+GNLY_Teff和Classical_NK细胞；在PSN-LUAD侵袭历程中，IFN-γ仅由NK细胞和CD8+Trm细胞开释。这解释了在PSN-LUAD的侵袭阶段，CXCL9+TAMs和CD8+Trm细胞之间的互相作用松开。

为了进一步进展IFN-γ对CXCL9+TAMs分化的影响，有计划东说念主员对IFN-γ支吾基因、颐养CXCL9抒发的高活性转录因子和与CXCL9+TAMs序贯分化辩论的基因进行分析，发现STAT1粗略反应IFN-γ的带领，并颐养卑鄙CXCL9辩论基因的抒发，从而影响CXCL9+TAMs的分化。此外，与其他TAMs比拟，STAT1在CXCL9+TAMs中涌现出更高的抒发水平。通过对STAT1和CXCL9在肿瘤发展不同阶段的抒发水平进行辩论性分析，有计划东说念主员阐述了STAT1和CXCL9之间的调控关系。在对TREM2+TAMs的不同分化阶段（SPP1 +和SPP1-）的分析中，转录因子NFATC1（+）、EGR3（+）、KLF6（+）和MAF（+）在TREM2+/SPP1-TAMs分化阶段涌现出高活性抒发。招引TREM2+ /SPP1+TAMs和TREM2+/SPP1-TAMs的DEG分析，有计划东说念主员发现EGR1、FOSB和STAT3在TREM2+/SPP1-TAMs中显耀上调。此外，有计划东说念主员发现BHLHE41（+）和NR1H3（+）不错平直调控SPP1的抒发，在带领TAMs向SPP1+表型发展中起重要作用（图5）。

图5 IFN-γ调控CXCL9+TAMs与CD8+Trm细胞之间的互相作用，影响GGN-和PSN-LUAD侵袭鬈曲的进展

6. 体内考证IFN-γ/STAT1通路在LUAD发生发展中的作用

有计划东说念主员分析了1590例原发性LUAD样本，并笃信了LUAD中最常见的突变基因，其中TP53（47%）和KrasG12D（36%）是最常见的两个癌基因。从CAG-Cas9-EGFP小鼠肺组织等分离AT2细胞并培养变成肺类器官。然后，sgRNAs和cDNAs被引入这些类器官中，以敲除和过抒发与东说念主类肺腺癌辩论的基因(Trp53−/−；KrasG12D)。明场图像涌现WT类器官涌现出组织讲求的囊性结构，Trp53-/-类器官涌现出多层上皮要素，而TK类器官变成了陈设杂沓的固体肿块。Ki-67染色涌现TK类器官具有较高的增殖率（图6）。

将经过基因剪辑的TK类器官移植到小鼠肺内，并使用荧光素酶活体成像和袖珍探究机断层扫描进行监测。活检涌现打针部位单个病灶有特异性绿色荧光卵白（GFP）抒发，教唆肿瘤发祥于移植的类器官。HE染色和免疫组化适度涌现，3周时出现早期LUAD，7周时进展为LUAD，11周时恶性进程更高。RNA-seq适度标明，跟着LUAD的发生和进展，免疫细胞浸润冉冉减少，这一发现与单细胞转录组学的适度一致，教唆跟着疾病的进展，肿瘤微环境中发生了免疫细胞耗竭。3、7、11周Western blot适度涌现，IFN-γ、STAT1、p-STAT1、CXCL9、CD8卵白抒发水平冉冉裁减，SPP1、CD44卵白抒发水平冉冉升高。并对3个阶段小鼠血清进行ELISA考证，适度与单细胞转录组学数据一致，标明单细胞转录组学适度的可靠性（图7）。

图6癌前肺类器官中Trp53−/−；KrasG12D驱动基因的生成

图7诳骗工程化肺类器官在小鼠中斥地不同阶段LUAD模子

小结

该有计划阐述了GGN-和PSN-LUAD的细胞组成和免疫支吾存在显耀异质性，并进一步揭示了CXCL9+TAMs和TREM2+TAMs过甚调控基因在LUAD进展不同阶段的各异富集和互相作用模式。IFN-γ通过激活STAT1信号通路和颐养CXCL9+TAMs与CD8+Trm之间的互相作用影响GGN-和PSN-LUAD的侵袭和鬈曲。

参考文件

Ren YF, Ma Q, Zeng X, Huang CX, Ren JL, Li F, Tong JJ, He JW, Zhong Y, Tan SY et al: Single-cell RNA sequencing reveals immune microenvironment niche transitions during the invasive and metastatic processes of ground-glass nodules and part-solid nodules in lung adenocarcinoma. Molecular cancer 2024, 23(1):263. DOI: 10.1186/s12943-024-02177-7.

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